技术支持TECHNICAL SUPPORT

COMMON PROBLEMS常见问题

      扩增子测序常见问题
    • 问:扩增子测序能满足的测序长度是多少?

      答:Miseq PE300平台测序长度为600bp,但其测序质量较差,质控需要过滤掉超过100bp质量较差的序列;Hiseq2500 PE250平台测序质量较好,但测序总长度为500bp,去掉12bp的barcode和部分质量较差的序列之后只剩460bp左右。所以保守起见,扩增子片段长度不能超过460bp,否则双端测序结果将无法进行拼接,在引物选择时应引起注意。

    • 问:DGGE技术与高通量测序技术在环境微生物群落多样性研究中有什么区别?

      答:DGGE等分子指纹图谱技术,在其实验结果中往往只含有数十条条带,只能反映出样品中的优势种群,需要标准菌株,且受到凝胶电泳特性的局限,无法检测到稀有菌群的种类,因此其重复性和分辨率都不甚理想。而高通量测序技术能同时对样品中的优势种群及微量菌进行检测,获得样品中的微生物群落组成,并将其含量进行数字化。

    • 问:扩增子测序与宏基因组测序的区别?

      答:扩增子主要分为16S、18S、ITS等测序,关注环境样本中的物种组成,该技术物美价廉,实用性高。宏基因组关注环境样本中的物种组成、功能组成及代谢通路等信息,该技术深入挖掘环境样本功能层面的信息。

    • 问:若关注环境中的真核微生物多样性,18S测序和ITS测序哪个更好?

      答:ITS测序主要是针对真菌多样性的研究,注释准确度高;18S测序针对的是真核微生物,注释到的范围广,但是就真菌来说精确度相对较低;可根据研究目的合理选择测序方案。

    • 问:是否需要生物学重复,多少个合适?

      答:为了数据质量、结果产出及顺利投稿,必须注意生物学重复问题。考虑到个体差异,后期组间统计学分析以及偏离样本,自然环境至少3个生物学重复,推荐5个;若是人类的肠道、粪便等样品,由于个体特异性高,建议10个以上的重复。从科学的角度来讲,最好能够整批样品同时测序分析,既可以减少不同批次间的系统误差,还能节省项目周期。若样品准备有困难,也可以分批次启动,但由此可能带来系统误差问题。

    • 问:扩增子测序和宏基因组测序的对象主要是环境微生物,请问针对此类样本推荐的DNA提取方法是什么?

      答:针对环境样本推荐老师采用常规的CTAB法或SDS法;其中人和动物组织样本使用SDS方法,其他样本采用CTAB法。另外,针对一些较难提取的样本或您希望提高样品DNA的提取效果,推荐使用Mobio公司专门的环境样本DNA提取试剂盒。 

    • 问:OTU进化树说明了什么问题?怎么看待其中的数字描述?

      答:OTU进化树是选取丰度排在前50且有属分类信息的OTU的代表性序列所构建的系统发育树。每个分支末尾的名称由属名和对应的OTU编号组成,若属名相同则使用同种颜色进行标记。该图可以看出相对丰度较高的属主要是哪些。此外,也包含了物种之间的进化分类关系,即不同的分支结构。但由于分析中针对的序列为16S等的部分区间,其中所含的信息并不完成,因此该图中的系统进化分支的信息可能并不完整或准确。各分支节点上的数值为bootstrap值,即置信度,该值的大小表征对应分支节点结构的准确性等,该值越大准确性越高。

      GeoChip功能基因芯片常见问题
    • 问:GeoChip与常规的核酸检测方法相比有什么优势?

      答:常规的核酸检测方法包括基因克隆文库、变性梯度凝胶电泳DGGE、温度梯度凝胶电泳TGGE、末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)、定量PCR和原位杂交等,尽管这些技术有一定价值,但它们的的缺点是信息量太小,不能充分反映复杂的环境微生物多样性和分布。基因克隆文库构建和检测的工作量大,且自然界中99%的微生物在实验室都没有办法纯化培养,从培养基上挑取克隆菌株,摇菌转化测序,效率低下。DGGE法曾经广泛应用于检测微生物群落结构或功能的多态性,但是需要标准菌株,且受到凝胶电泳特性的局限,无法检测到稀有菌群的种类,因此其重复性和分辨率都不甚理想。GeoChip涵盖了多个功能类别,同时,这些相关功能基因涉及了细菌、古菌、真菌、原生生物、病毒等多种生物类群,较常规的研究方法更加简便、经济、快捷,能在短时间内获得更多更准确的信息。

    • 问:GeoChip与扩增子测序技术和PhyloChip相比有什么优势?

      答:扩增子测序以及PhyloChip都能揭示群落的系统发育信息,适用于16S rRNA基因的检测,但是这些技术都依赖于PCR的扩增以及保守性引物。而扩增子测序也适用于部分功能基因的检测,然而大部分的功能基因仍不能设计出足够保守的PCR引物,也就是说除了GeoChip以外目前只有极少数的功能基因能通过测序的办法检测。不仅如此,这些基于传统PCR扩增的测序技术由于扩增偏好性的客观因素仍很难实现准确定量,且这些技术对系统的随机误差极其敏感。尽管通过获得系统中绝大部分物种的序列信息能在很大程度上消除这些误差,但是依据目前的测序技术需要付出巨大的成本。相比之下,基于芯片的杂交技术对随机误差并不敏感,而只需关注芯片中明确的基因,且GeoChip技术对物种的分辨率也高于基于16S rRNA基因的扩增子测序。但是,基于测序的检测技术能有助于我们发现新的基因和功能信息,因此,综合利用多种高通量的检测手段能更全面地揭示微生物群落的系统发育以及功能结构,最终更好地回答我们的科学问题和假设。a级黄色片与很多公司和机构一样提供扩增子测序服务。此技术需要较为少量的环境样品DNA,通过基于保守引物的PCR扩增来或者群落的系统发育基因(如16S rRNA基因)或功能基因(amoA基因)。扩增子测序一般可以对多个样品进行混样后进行。

    • 问:能否保证定位到的候选区域的大小和候选基因的个数?

      答:候选区域的大小和候选基因个数的多少,与群体的大小、亲本材料差异的大小、目标性状特点、测序深度的多少、分析物种的基因组水平等多项因素相关,因此不能给出统一的标准,但可以参考已完成的项目经验进行估计。

    • 问:没有参考基因组的物种能否做BSA性状定位?

      答:没有参考基因组的物种可以进行SNP频率差异分析,可以找到候选区段,但是无参定位效果较差,并且缺少注释文件,获得的结果少。无参物种一般情况不推荐做BSA性状定位,建议尝试遗传图谱等方案。

    • 问:GeoChip和宏基因组应如何选择?

      答:GeoChip是根据微生物相关的各类功能基因独立设计特异性的探针,能极大地降低特殊样品中动植物宿主基因组对微生物群落功能检测的影响,且具有平行样品间结果高重现性高和高灵敏度的等特点,适用于探索已知基因及物种的未知规律。宏基因组技术直接针对微生物群落总的DNA进行测序,其数据量巨大。尽管宏基因组测序可以发现新的基因,然而我们能获得序列片段和信息更多只能来源于高丰度的物种或多拷贝的基因。同时,对如此大量的数据进行深入分析是个十分巨大的挑战。GeoChip和宏基因组都关注环境样本中的物种组成、功能组成及代谢通路等信息,均可用于挖掘环境样本功能层面的信息。

    • 问:GeoChip、HuMiChip、PathoChip和StressChip有什么联系和区别?

      答:HuMiChip是针对人类相关微生物重新设计的芯片,涵盖的探针与GeoChip没有重复,PathoChip病原芯片和StressChip抗性芯片有部分探针来自GeoChip。

    • 问:GeoChip检测结果能否跟宏基因组测序结果进行比较?

      答:GeoChip与宏基因组测序相比,在技术原理、定量方法、定量性能、对未知物种探查能力等多方面有显著差别,各有优劣,其结果可互为补充,但是无法直接比较。

      动植物基因组重测序常见问题
    • 问:简化基因组BSA比全基因组BSA价格便宜?

      答:简化基因组技术,捕获的基因组信息占基因组大小约1%~10%,全基因组技术,对整个基因组测序,获得的变异信息更全面,性价比更高,数据量单价便宜至少25倍。

    • 问:DNA样品如何混池?先混样再提DNA?还是先提DNA再等量混合?

      答:先提DNA再等量混合,可以减少系统误差,近年发表的多数文献都是先提DNA再等量混合。

    • 问:能否保证定位到的候选区域的大小和候选基因的个数?

      答:候选区域的大小和候选基因个数的多少,与群体的大小、亲本材料差异的大小、目标性状特点、测序深度的多少、分析物种的基因组水平等多项因素相关,因此不能给出统一的标准,但可以参考已完成的项目经验进行估计。

    • 问:没有参考基因组的物种能否做BSA性状定位?

      答:没有参考基因组的物种可以进行SNP频率差异分析,可以找到候选区段,但是无参定位效果较差,并且缺少注释文件,获得的结果少。无参物种一般情况不推荐做BSA性状定位,建议尝试遗传图谱等方案。

    • 问:多倍体物种可以进行BSA性状定位吗?

      答:已经组装的多倍体参考基因组物种,例如:“油菜、烟草、棉花”,可以用BSA进行性状定位。

    • 问:人工诱变只能是EMS诱变吗?其他诱变方式得到的性状可否采用BSA性状定位?

      答:BSA性状定位是基于SNP,通过比较SNP频率差异进行分析的,EMS诱发的是点突变,所以EMS诱发的突变适合这种分析方式;其他的诱变方式诱发的大部分是结构变异,在SNP水平上可能找不到导致目标性状差异的区域,所以不适合SNP频率分析的方法。

    • 问:2013年,Henke等总结了全基因组BSA相比转录组(RNAseq)进行性状定位的优点。

      答:1. 覆盖范围:全基因组BSA可以覆盖整个基因组,而RNAseq只对编码区进行测序。
      2. 基因检测的偏好性:全基因组BSA对基因的检测较均匀,无偏好性,不受时间或者组织的影响。RNAseq偏向于在特定时间或者组织中高表达的基因。
      3. 区域偏好性:基因分布不均匀,若一些区域基因密度低,用RNAseq可能漏掉。
      4. 多态性:基因组的多态性多数位于非编码区,采用RNAseq检测到的多态性较低,只有少数与突变位点连锁的多态性标记能被RNAseq检测到。因此,采用全基因组BSA更容易检测到与目标基因连锁的多态性标记。