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项目文章|微囊藻素降解有妙招?群体感应系统前来报道!

来源:admin    发布时间:2020-07-15   阅读数:361

a级黄色片项目文章再下一城!近日,清华大学深圳国际研究生院海洋科学与技术学部蔡中华研究员及其研究团队的研究成果刊登Water Research。研究针对微囊藻毒素降解菌Novosphingobium sp. ERW19的两套群体感应系统进行了探索。本文的通讯作者为周进老师,曾艳华博士后参与了本次研究的主要工作。热烈祝贺蔡中华研究员及其研究团队!

Two hierarchical LuxR-LuxI type quorum sensing systems in Novosphingobium activate microcystin degradation through transcriptional regulation of the mlr pathway Novosphingobium 的双层级LuxR-LuxI型群体感应系统通过调控mlr通路的转录来激活微囊藻素降解

微囊藻素降解有妙招?群体感应系统前来报道出处证明图

作者:Yan-Hua Zeng, Zhong-Hua Cai, Jian-Ming Zhu, Xiao-Peng Du, Jin Zhou

期刊:Water Research

时间:2020.6.22

IF:7.913

DOI: 10.1016/j.watres.2020.116092


摘要

有害赤潮产生的微囊藻毒素 (Microcystins,MCs) 是最常见的蓝藻毒素,它在全球范围对人类健康和生态环境都造成了威胁。生物降解能有效且持续的消除MCs。虽然MCs的生物降解代谢途径已经探明,但降解过程的调控机理仍不明了。群体感应(Quorum sensing,QS)是一种细胞密度调控机制,可帮助细菌协调集体行为。酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactone,AHL)介导的QS系统能调节多种有机污染物的生物降解,但这个系统能否降解MCs还是未知数。在该研究中,MCs能使AHL产生菌比例大幅增加,依赖于AHL的QS系统出现在所有MC降解细菌中,证明QS参与MCs的降解。针对mlr降解途径的marker基因mlrA设计新引物,我们分离到了两株拥有MC降解和AHL生产功能的Novosphingobium菌株。其中Novosphingobium sp. ERW19编码双层级QS调控系统novR1/novI1和novR2/novI2。基因敲除及补偿实验证明这两套系统对于MCs的完全降解很重要。转录组分析显示QS系统可激活MC降解基因尤其是mlrA来降解MCs。QS可能是MC降解细菌的特征,调控QS系统是控制MCs降解的有效策略。


实验设计

1、于太湖赤潮期间取水样,分离水样的微生物,及在水样中添加MCs富集微生物。筛选能产生AHL的阳性菌,最后筛选到2株还检测到mlrA基因的菌株Novosphingobium sp. ERW19和ERN07,对其进行基因组测序和草图组装分析;

2、测试Novosphingobium sp. ERW19及其变种降解MCs的能力;

3、分别构建Novosphingobium sp. ERW19菌株的QS缺失缺陷体和补偿菌株。分析AHL合成情况、MCs降解及AHL合成核心基因的表达情况;

4、使用RNA测序检测各菌株的基因表达量(a级黄色片承担本研究RNA测序分析工作)。


实验结果

1、富集前后AHL生产菌的变化

AHL是细胞间最常用于交流的自诱导剂。从赤潮水样中分离到120个菌株中有11种具有AHL生产能力,富集后得到的41种菌株中有13种具备AHL生产能力。这说明信号交流可显著增加AHL生产菌的丰度,反映了QS可能参与MC降解细菌的生物降解行为。

以上的24种AHL生产菌都是变形菌,主要分为Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria 两个纲。图1展示了AHL生产菌富集前后的群落变化,富集前高丰度物种有Aeromonas(63.64%)和Rhizobium (18.18%)等,富集后演替成Novosphingobium(46.15%)和Rhizobium (15.38%)等。

富集前后赤潮水样中的AHL生产菌的相对丰度图
图1 富集前后赤潮水样中的AHL生产菌的相对丰度

2、依据AHL生产能力筛选MC降解菌

mlrA基因是能降解MCs的marker基因,本实验针对该基因设计新引物mlrA-271F和mlrA-806R作为快速筛选MCs降解菌的工具。从菌株ERW19和ERN07中成功扩增出了mlrA基因,该基因与Novosphingobium sp. THN1的序列相似性为100%。


3、MC降解菌基因组的QS鉴定和AHL合酶的功能验证

目前已经测序过的7株MC降解菌都属于Sphingomonadaceae科,都至少含有一个AHL驱动的QS回路,而该科其他无降解功能的细菌却没有该结构。这也说明了基于AHL的QS系统与MC降解之间关联紧密。 对7株MC降解菌的luxR/luxI基因进行线性分析,发现了11个luxI同源基因,所有luxR位于luxI上游。luxI的氨基酸序列可分为3类(图2A,B),相似性在22%到100%之间。 将降解MCs能力更强的Novosphingobium sp. ERW19的QS系统作为典型代表进行研究。该菌株有2个AHL合酶ERW19_NovI1和ERW19_NovI2,它们的产物不同(图2C),前者的产物似乎是Sphingomonadaceae的主要信号物。

七株MCs降解菌的luxI/R 共线性分析图
图2 七株MCs降解菌的luxI/R 共线性分析

4、Novosphingobium sp. ERW19的QS系统特征

该菌编码2个完整的luxR/luxI型QS系统,novR1/novI1和novR2/novI2。WT株系与农杆菌A136共培养24h后能产生蓝色斑点,说明WT合成的AHL具有强烈活性。4个QS缺陷体中只有ΔnovR2有明显的AHL活性(图3A),提取实验的结果与这一致(图3B),这说明在QS系统中novR2可能是AHL的抑制物。两种类型的AHL可在WT菌株上清液中检测到(图3C),novR2的敲除使AHL类型增加了一种。而分别单独敲除novI1、novR1、novI2后细菌的MCs降解能力显著降低了。双敲缺陷体ΔnovI1novI2无法产生AHL,证明ERW19只编码2种AHL合酶。在QS缺陷体中重新引入之前删除的基因后,菌株又恢复了AHL生产能力(图3A)。

交叉共生实验鉴定ERW19 WT及其缺陷体的AHL信号物质生产图
图3 交叉共生实验鉴定ERW19 WT及其缺陷体的AHL信号物质生产

使用ERW19的WT及其缺陷体来验证novR1/novI1和novR2/novI2两种QS系统的关系。分别敲除novR1和novR2基因后,novI1和novI2的表达量显著增加(图4),说明两个AHL合酶受其受体的正调控。删除novR1后novI2的表达量显著降低,说明novR1/novI1能够正调控novR2/novI2。这也解释了ΔnovR1合成AHL的数量降低的原因是因为novR1抑制了AHL合酶基因的表达。

novR2的删除显著上调了novI1的表达,因此缺陷体ΔnovR2(图4)能产生更多AHL主要归功于novI1的高表达。可能缺少了novR2/novI2的竞争,ΔnovR2能产生更多AHL。然而ΔnovI2中的AHL活性非常低(图4B),可能是其活性受到其他多种因素的共同影响。总之,ERW19的2个QS系统中,novR1正调控novI2的表达,而novR2会抑制novI1,这样就形成了一个正/负反馈环。

ERW19 WT及其缺陷体的AHL合酶基因novI1及novI2的表达量图
图4 ERW19 WT及其缺陷体的AHL合酶基因novI1及novI2的表达量

5、两个QS系统的对MCs降解的调控作用

所有QS缺陷体对MCs的降解能力均降低了(图5A,C),在基因补偿实验中ΔnovI2和ΔnovR2的MCs降解能力恢复(图5B,D),但ΔnovI2和ΔnovR2仅部分恢复。

ERW19 WT、缺陷体及补偿菌株中的MCs降解曲线图
图5  ERW19 WT、缺陷体及补偿菌株中的MCs降解曲线

在不同菌株中,涉及MCs降解的两个QS系统相关基因的表达量和与其MCs降解能力一致(图3A,B)。虽然novR2的敲除增加了菌株的AHL生产能力,但对MCs的降解效率是有所降低,可能是因为novR2的敲除使novI2的表达也大幅下降(图5A,C)。由此可知,novR1/novI1和novR2/novI2都能增强QS系统对MCs的降解,任何QS元件的缺失都将导致降解效率降低。

qPCR也证实了QS系统通过诱导mlr途径来正调节MCs的降解(图6)。此外,QS还正调控苯乙酸降解途径基因,该基因亦参与MCs的下游降解途径(图6)。

 基因删除及恢复对AHL合酶基因表达的影响图
图6  基因删除及恢复对AHL合酶基因表达的影响

小结与亮点

本研究发现,赤潮期间水中的AHL生产菌丰度升高,而所有的MCs降解菌种均含基于AHL的QS系统,因此针对其中的MCs降解菌Novosphingobium sp. ERW19的两套QS系统进行了探索。研究结果表明novR1可以正调控novI2的表达,而novR2的表达与novI1负相关。两套QS系统在MCs的降解方面发挥了重要作用。QS系统降解活性的产生由MC降解基因尤其是mlrA的表达诱导。总之,该研究阐明了QS的MCs生物降解功能,在消除MCs时可以据此来提高生物膜体统的净化功能。



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