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三氯乙基磷酸酯在沉积物中的生物转化以及对微生物群落的影响

来源:admin    发布时间:2020-07-28   阅读数:167

三氯乙基磷酸酯在沉积物中的生物转化以及对微生物群落的影响

Biotransformation of tris(2-chloroethyl) phosphate (TCEP) in sediment microcosms and the adaptation of microbial communities to TCEP

作者:Xiangyu Zhou, Yi Liang, Guofa Ren, Kewen Zheng, Yang Wu,Xiangying Zeng, Yin Zhong, Zhiqiang Yu, and Pingan Peng

期刊: Environmental Science&Technology

IF:7.149

DOI:10.1021/acs.est.9b07042


一、研究背景

有机磷酸酯(OPEs)在工业产品中通常作为钝化剂、塑化剂、消泡剂、添加剂使用,随其广泛使用,水体、沉积物、土壤等很多环境类型中都有检出。部分OPEs的致癌和神经毒性让其成为了公共健康和生态系统的潜在风险。

作为主要典型的氯代OPE-TCEP就被发现广泛存在污水处理系统中,且很难被清除。而经济友好型、环境友好型的微生物降解成为了清除TCEP不可多得的好办法。有研究报道Sphingobium sp.TCM1能够通过多种磷酸酶降解TCEP,Flavobacteria存在的海水中也观测到了TCEP的降解。因此本文作者设计了设计了相关实验观察和发现了沉积物培养体系中微生物群落对TCEP的生物降解情况,并对主要降解的化合物进行了定量检测。


二、实验设计

作者从河北一污水河中采集了作为后续整个实验培养接种源的沉积物,检测带有微弱的TCEP背景(4.83mg/L),低温运送至实验室后,每10g 沉积物于含有90mL MSM培养基的培养瓶中进行培养,每一培养瓶实验前期先加入5mg/L TCEP(Group ST),96h后加入 50mg/LTCEP培养36h。设置了碳源对照Group SA(添加醋酸钠)、GroupS(只有沉积物培养)以及用于检测非生物过程损失的Group AT(添加TCEP和灭菌的沉积物)和Group T(只添加TCEP)。120 rpm和25℃培养后每一培养瓶分别取1mL和1.5mL混合物进行化学分析和DNA提取。
用DNeasy PowerSoil kit提取Group ST、SA和S样本的DNA,用515f/806r扩增16S rRNA基因,于Illumina Hiseq平台进行了扩增子测序。同时Group ST、SA第二次TCEP 50mg/L培养样品也提取了DNA进行宏基因组测序(X Ten),测序部分均由看一级特黄a大片承担完成。扩增子测序数据经质控拼接后于97%相似度聚类成OTU,共得到7,483个OTU,用Silva数据库进行物种注释,样本平均测序深度为103,976条序列;宏基因组平均每样本测序深度18.1Gb,测序reads经过质控拼接后,用MetaGeneMark进行ORF预测,于NCBI nr数据库和KEGG进行了物种和功能注释。

对于TCEP在微生物群落生物降解过程中存在的主要降解物形式,用UHPLC-Orbitrap Fusion TMS液质联用的方法进行了定性检测,同时也用LC-MS/MS对TCEP和BCEP进行了定量分析。


三、实验结果

质谱通过m/z比和同位素比值分析发现TCEP降解过程中主要的存在形式是BCEP和MCEP,该结果意味着TCEP的微生物降解里包含着磷酸酯基团的水解反应。同时其他P3、P4、P5位的化合物TCEP-OH、TCEP-CHO、TCEP-COOH也有检出,说明TCEP的降解中也包含了羟基化作用。

对TCEP和BCEP降解和累积的定量分析发现TCEP降解符合零级动力学(反应速率0.068mg/L/h),在Group AT(灭菌沉积物)中TCEP未有明显降解,说明其降解是微生物介导参与的。在50mg/L添加浓度下,TCEP以1.85mg/L/h的速率消失,比5mg/L浓度下快27倍。BCEP作为TCEP的主要中间体,在第一次和第二次添加后,最终在检测物中摩尔占比分别为24.8%和37.3%(图1),说明TCEP降解过程中的BCEP可能会继续对微生物群落结构产生影响(图1C,D)。

 
图1.TCEP和BCEP的降解动力学


16S rRNA扩增子分析物种群落结构共得到48个门,其中21个相对丰度>0.5%,Proteobacreria是丰度最高的门(34.6%-50%),其次是Bacteroidetes(23.4-38.9%)、Chloroflexi(4.3-9.5%)。Proteobacreria,Betaproteobacteria(12.4-29.7%)丰度最高,其次是Alphaproteobacteria(7.4-12.9%)、Gammaproteobacteria(5.3-6.6%)和Deltaproteobacteria(2.9-5.1%)。第一阶段添加下(5 mg/L TCEP),TCEP添加组GroupSA和GroupS的微生物群落结构很相似(图2A),可能是因为之前接种沉积物本身TCEP背景导致的。在第二阶段TCEP  (50 mg/L) 添加中,实验组和醋酸添加或者无碳源添加组的微生物群落差异很大(图2A),Alphaproteobacteria和Betaproteobacteria相对丰度都显著增加(9.8%→11.6%;17.4%→24.6%),其中Alphaproteobacteria的Rhizobiales和Rhodobacterales目,Betaproteobacteria的Burkholderiales和Methylophilaceae目得到了不同程度的富集(图2B,2C),这些菌可能在TCEP的降解中起着不同的作用。但6个被鉴定为Sphingobium(0.5%-1.5%)的OTU相对丰度在所有培养条件下丰度都是下降的,并未发现之前报道的TCEP降解菌株TCM1的富集情况,可能磷酸盐丰富的情况下会抑制Sphingomonadaceae的生长。

 
图2.NMDS分析


KEGG基因功能注释分析发现,Mtabolism category的基因丰度最高(52.2-53.5%),然然后是Environmental Information Processing category(14.1-16.1%),同时也发现了和MCEP水解有关的碱性和酸性磷酸酶基因,主要存在于Alpha-, Beta-, Gammaproteobacteria, Actinobacteria和Bacteroidetes中。其中Rhizobiales和Burkholderiales相关的碱性磷酸酶基因以及和Actinobacteria、Gammaproteobacteria相关的酸性磷酸酶基因在TCEP添加组中丰度显著提高(图 3),说明相关微生物在TCEP的降解中扮演着重要角色。同时编码2-chloroethano(2-CE)代谢相关的基因都有不同程度的提高,证明2-ce作为tcep代谢产物被生成,也被继续降解(图3)。

 
图3.在TCEP影响下,磷酸酶相关基因的丰度变化


四、结论

本文作者鉴定了TCEP添加污水沉积物培养的微生物群落结构,发现TCEP的添加确实会改变微生物的群落结构,同时TCEP的微生物降解主要通过磷酸酯基团的水解进行,主要产物是BCEP和MCEP,还可能通过水解脱氯形成TCEP-OH进一步氧化生成TCEP-CHO和TCEP-COOH进行降解。TCEP的高浓度添加会增加其降解速率进而会对Burkholderiales,  Rhizobiales、Rhodobacterales和 Methylophilaceae产生富集作用,这些富集的微生物通过碱性、酸性磷酸酶和2-CE degradation的降解途径降解TCEP,说明不同的微生物群落采用了不同的降解机制参与TCEP的降解过程。




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