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Nanopore宏基因组学临床快速诊断细菌性下呼吸道感染

来源:admin    发布时间:2020-08-10   阅读数:164

今天带来Nature Biotechnology上的佳作一篇,作者基于Nanopore高通量测序平台搭建了一套能够有效去除人体DNA干扰,且能在6h内快速检测下呼吸道感染病原的检测流程。 a级黄色片现已推出“三+二”宏基因组测序策略,如对本产品感兴趣可通过文末方式联系我们!

a级黄色片|Nanopore宏基因组学临床快速诊断细菌性下呼吸道感染

Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratory infection

Nanopore宏基因组学临床快速诊断细菌性下呼吸道感染

作者:Themoula Charalampous, GemmaL.Kay, Hollian Richrdson, et al.

作者: Nature Biotechnology

时间:2019.07

IF:31.864

DOI:10.1038/s41587-019-0156-5


研究背景

呼吸道感染(RIs)病原的快速检测一直是医疗中亟待解决的问题。目前医疗中对RIs病原检测的方法主要依赖培养和敏感实验,这种方法耗时并且敏感度不高,对疾病治疗前期病原的快速确定和抗生素使用提供不了及时准确的指导,同时也会导致抗生素的滥用以及病人肠道微生物群落的紊乱。

随着高通量测序技术的发展,已有研究将其运用于临床RIs病原的快速检测,但RIs样本类型众多并且病原含量差别很大,同时带有大量的人体细胞,给这一运用推广带来了不小的难度。因此本文作者基于Nanopore高通量测序平台搭建了一套能够有效去除人体DNA(99.99%)干扰并且能在6h内快速检测下呼吸道感染(LRIs)病原的检测流程。


实验设计

作者从NNUH(UK)医院得到许可后共获得81例已经做过培养和抗性检测的呼吸道样本。样本按照预实验和优化实验分别包含40例和41例样本。预实验为34阳性样本、6NRF,共涉34痰液、4BAL和2ETAs;优化实验包括29例疑似感染样本,9NRF样本和3NSG样本,共涉38痰液,1个BAL和2ETAs样本。

LRIs检测流程中为了尽可能去除宿主DNA提高检测灵敏度,在优化实验的人体宿主细胞去除、微生物DNA提取和nanopore测序三个步骤里较预实验都做了对应的优化,比如宿主DNA去除时找到了合适浓度的saponin(2.2%),HL-SAN步骤由两步减为一步,清洗步骤缩减为2次,详情见图1。

图1 nanopore宏基因组快检流程
图1 nanopore宏基因组快检流程

所有样本提取得到合格的DNA后建MinION文库,预实验和优化实验分别取了48h完整测序和测序前2h的 reads 用于下游数据分析。测序reads通过mapping去除人体reads后于EPI2ME平台用WIMP对reads进行病原物种的注释(RefSeq),用ARMA进行抗性基因检测(CARD database)。在本次检测中作者参照常规培养检测阈值(105病原/mL样本)建立了基于测序的thresholds,对应病原物种reads≥1%时为阳性,抗性基因则是大于等于一个比对(alignment)。本次实验中也设计了对应的病原菌添加实验检测了优化方法的检测线(LoD)以及评价了基于qPCR检测的mock community实验检测核心依赖saponin去除宿主DNA方法对细菌DNA的损伤大小。最后也开展了细菌基因组拼接的工作。


主要结果

通过预实验对40个疑似LRI样本的高通检测发现该方法可以达到91.4%的敏感(sensitive)度和100%的特异性(specific)(表1),通过qPCR检测,用saponin对人体DNA的去除率达到了99.9%,其对比传统培养实验有更好的检出率(5个样本未在培养中检出),共耗时8h。

表1 预实验病原菌检出统计

预实验病原菌检出统计

随后在优化检测实验中,通过加入bead-beating增加细菌细胞溶解、减少宿主去除中第二次DNAase处理、减少清洗次数以及减少建库的循环时间(6min 到4min)等优化整个流程时间大大减少缩短至6h。该方法的LoD能达到103-105(c.f.u)mL-1,并且在去除宿主DNA的步骤中对细菌DNA的损失基本可忽略不计。41个样本对病原菌的检测能够达到96.6%敏感度(95%CI,80.4-99.8%)和41.7%特异性(95%,16.5%-71.4%)(表2)。在病原检出率方面该方法对比传统培养优势巨大,除了能检出培养方法中已检出的病原菌,还在其他8个样本中检出了其他的病原菌,在7个MRF/NSG样本中检测出潜在的致病菌。通过未去除宿主DNA平行检测试验的矫正下,优化方法最终将特异性提高到100%。

表2 优化实验病原菌检出统计

优化实验病原菌检出统计1图

优化实验病原菌检出统计2图

41个优化实验测试样本中共检测到了183个抗性基因,其中26个存在可培养的菌株中,比如K.pneumoniae的aqxA/B和P.aeryginosa的blaOXA-50,不过目前的方法并没有确定抗性基因检测的敏感性和特异性。

通过有参组装对两个去除和未去除宿主DNA样本的基因组组装分析发现,对于拼接组装的目标E.coli 基因组,在去除宿主样本中无论是contigs数量还是基因组的覆盖度较未去除宿主的样本都得到了很大的提高,并且去除宿主样本2h的短时测序已经能够满足对病原菌的检测数据量,说明作者基于saponin去除宿主DNA的方法去除效果显著从而减少了检出病原菌所需的测序时间(图 2)。

a级黄色片|去除和未去宿主DNA细菌基因组组装
图2 去除和未去宿主DNA细菌基因组组装


结论

本文作者基于Nanopore高通量测序技术搭建的LRIs快速检测流程,通过优化基于sapoin去除宿主DNA、DNA提取和建库流程等步骤,区别常规培养检测的2-3天,把整个流程时间缩短到6h,这对临床快检意义重大,不仅可以快速检测病原菌而且可以指导抗生素的准确使用。整个方法在41例样本的最终检测中达到了96.6%的敏感性和100%的特异性,期待在未来得到更加广泛的临床运用。




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