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瘤胃微生物的抗生素抗性基因鉴定

来源:admin    发布时间:2020-08-27   阅读数:119

Characterization of antibiotic resistance genes in the species of the rumen microbiota

瘤胃微生物的抗生素抗性基因鉴定

作者:Yasmin Neves Vieira Sabino, Mateus Ferreira Santana, Linda Boniface Oyama等

期刊:Nature Communication

时间:2019.11.20

IF:12.35

原文链接:https://doi.org/10.1038/s41467-019-13118-0


一、研究背景

多种药物耐受的细菌的感染给临床和畜牧治疗带来了很大挑战,人们对反刍动物胃肠道细菌的抗生素抗性基因 (Antibiotic-Resistance Genes, ARGs)流行情况还不甚了解。本文对435个反刍动物的微生物基因组进行了研究,并对代表性抗性表型进行了体外验证。发现大量微生物基因组存在四环素抗性基因且其中的tet(W)处于正选择压力之下。在几个细菌基因组中tet(W)位于新整合性结合元件(Integrative and Conjugative Elements, ICE)之上。此外,本研究还使用宏转录组数据分析了活跃转录的抗性基因。总之,我们对反刍动物瘤胃的关键微生物进行了抗生素抗性研究,揭示可移动遗传元件対瘤胃微生物耐药方面起到的潜在功能,为人类和动物的健康提供了应用依据。


二、实验设计

1. 基因组数据的选择和ARGs的鉴定及统计分析

从Hungate1000项目选择435个瘤胃动物微生物的基因组序列(425个细菌和10个古菌),用3种软件(ARG-ANNOT、ResFinder和Resfams)寻找抗生素抗性基因并进行分类。

对下载的微生物16S rRNA数据进行进化分析,以探究ARGs与微生物的进化关系;确定高频率出现的ARGs在基因组中的位置,评估其保守性。

2. ARGs的遗传内容及ICEs保守性

为了研究ARGs的可转移机制,我们对约4000bp、包含抗性基因的scaffold进行分析,预测其上的蛋白遗传元件及其功能并寻找整合性结合元件及其携带的ARGs。同时对这些 ICEs进行聚类分析以评估其遗传保守性。使用PCR法检测一个在Blautia schinkii中预测到的新ICE是否真实存在。

3. ARGs的选择压力和抗性表型的体外验证

预测ARGs中发生错义突变和无义突变的位点数量,以评估ARGs的选择压力。对26个含有ARGs的瘤胃微生物进一步进行体外验证,即培养这些微生物并用E-test试条测试其耐受的抗生素及浓度。

4. 宏转录组分析

下载15份牛和羊的代表性宏转录组数据,验证高丰度ARGs的表达量。


三、实验结果

1. 瘤胃微生物中的ARGs检测

使用3个分析软件对瘤胃微生物基因组中ARGs的数量和分类进行统计。ResFinder从72个基因组中找到11类、141个ARGs,ARG-ANNOT从93个基因组中找到10类、754个ARGs,而Resfams则在430个基因组中发现了9类ARGs的3148 条序列(表1)。丰度最高的ARGs为β-内酰胺类、糖肽类、四环素类和氨基糖苷类,它们集中出现在厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门基因组中(表1)。

表1 瘤胃微生物ARGs的预测

瘤胃微生物ARGs的预测


2. ARGs的进化分布

ARGs在瘤胃微生物中普遍存在(图1),一些特殊ARGs则倾向于出现在某些特定的细菌中。例如,很多变形菌门微生物有ARGs,其中的肠杆菌科均可以检测到ARGs,拟杆菌门及放线菌门的ARGs分别集中在拟杆菌属和双歧杆菌属中。而一些细菌门则没有检测到ARGs,也可能是这些门的物种丰度很低。

抗性基因在瘤胃微生物的分布图
图1 抗性基因在瘤胃微生物的分布

根据16S rRNA将瘤胃微生物进行聚类并展示ARGs分布情况(图2)。69.2%的基因组都含抗性基因,其中拥有tet(包括tet(W)、tet(Q)、tet(O))抗性的基因组最多。进化分析结果显示,tet(W)在28个基因组中的序列相似性达94.9%以上,序列覆盖度达99%。

ARGs在物种中的分布差异较大。例如,喹诺酮类抗性基因只存在于表皮葡萄球菌和柠檬酸杆菌NLAE-zl-C269中,甲硝唑和磷霉素抗性基因只分别存在于普氏菌属及2个表皮葡萄球菌菌株中(图2),而β-内酰胺抗性基因集中在肠杆菌科、拟杆菌属及其他2个进化分支中。值得注意的是,大肠杆菌PA-3的ARGs高达5个。


图2 ARGs在瘤胃微生物中的分布

3.ARGs的遗传内容

我们研究了tet(W)的遗传位点及其侧翼区域,以评估tet的可转移潜力。ResFinder在28个基因组中找到了18条包含tet(W)的scaffold,这些长4000bp左右的序列中都有甲基转移酶编码基因,且临近或直接位于tet(W)上游或下游。这28个基因组中有7个在临近tet(W)的地方有Maff-2蛋白编码基因,该基因与tet抗性有关。10个基因组存在转座子蛋白编码基因,22个基因组有细菌接合相关编码基因。此外,噬菌体蛋白编码基因也出现在了10个基因组中。

至少有7个基因组存在功能完整的ICEs。以Blautia schinkii DSM 10518的ICE为例,该ICE有多种可转移遗传元件及相关基因,包括接合蛋白、分泌蛋白、重组酶等多种相关编码基因(图3a)。PCR法证明了新ICE(命名为ICE_RbtetW_07)的存在,进一步验证了瘤胃微生物发挥四环素抗性是由ICE上的保守元件介导的假设(图3b)。

ICE_RbtetW_07的结构和保守性
图3 ICE_RbtetW_07的结构和保守性

4. 四环素抗性基因选择压力分析

用密码子置换率(dN/dS值)来表征四环素抗性基因的进化情况。Tet(W)蛋白的639个氨基酸残基中有36个的dN/dS值>1,说明主要分布于3个位点的这36个氨基酸存在正选择压力(图4a)。而Tet(Q)和Tet(O)分别有25个和17个氨基酸可能存在正选择压力(图4bc),但dN/dS值<1,加上似然比检测结果也不显著,说明这2个基因不存在选择压力。

四环素抗性基因选择压力分析图
图4 四环素抗性基因选择压力分析

5. 抗生素表型测试

挑选26种纯培养菌(含57种抗性基因)进行抗生素抗性体外验证,结果显示其中的18个具有抗性。ARG-ANNOT、ResFinder和Resfams软件预测的准确率分别是71.4%、64.3%和32.1%,前两个软件的预测结果与体外验证结果更接近。

3种方法都能检测到tet基因存在的微生物占69%,证明了该基因的普遍性。某些抗性基因即使只被一种生信工具预测到,它们也能赋予微生物相应的抗生素抗性,如存在于梭菌属、Lachnoclostridium和瘤胃乳酸菌DSM 2040的万古霉素抗性基因,存在于伪长双歧杆菌DSM 20092的氨基糖苷抗性基因,等等(图5)。

图5 抗生素抗性预测及体外验证的一致性
图5 抗生素抗性预测及体外验证的一致性


6. ARGs的表达量

牛和羊瘤胃微生物转录组的15份样品中都能检测到ARG(图6),丰度排在前五位的分别为氨基糖苷类、酰胺类、大环内酯类、四环素类和万古霉素类,其中四环素类的表达量最高。在不同的样本中ARGs表达量有所差异,有些整合在微生物基因中的ARGs(如strA、cepA、ermB等)在所有样本中均未检测到表达(图6)。

图6 ARGs的表达水平 

图6 ARGs的表达水平(RPKM)


四、小结与亮点

本研究预测了435个瘤胃微生物基因组中抗生素抗性基因及其分布情况,结果显示β-内酰胺类、糖肽类、四环素类和氨基糖苷类抗性基因是最丰富的ARGs,它们集中出现在厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门和放线菌门基因组中。tet(W)序列保守,其侧翼序列结构显示该抗性基因可以通过ICE在微生物间水平传播。体外验证与抗性预测结果大体一致,而tet抗性基因的高表达和一些抗性基因的低表达也与体外验证结果相符。总之,该项目对瘤胃微生物的抗生素抗性特征进行了研究,为进一步探索瘤胃微生物ARGs提供了依据。




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