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柯赫氏法则揭示肠道微生物失调导致虾白便综合症

来源:admin    发布时间:2020-09-09   阅读数:82

Microecological Koch’s postulates reveal that intestinal microbiota dysbiosis contributes to shrimp white feces syndrome

柯赫氏法则揭示肠道微生物失调导致虾白便综合症

作者:Zhijian Huang1,2,3,4*, Shenzheng Zeng1,4, Jinbo Xiong5, Dongwei Hou1, Renjun Zhou1, Chengguang Xing2, Dongdong Wei1, Xisha Deng1, Lingfei Yu1, Hao Wang2, Zhixuan Deng1, Shaoping Weng2,3, Satapornvanit Kriengkrai6, Daliang Ning7, Jizhong Zhou7and Jianguo He1,2,3,4*

期刊:Microbiome

时间:2020

IF:10.465

DOI:10.1186/s40168-020-00802-3


一、研究背景及结果

1、背景

近来很多研究表明,一些复杂疾病并不只是单一病原体造成的,而是由宿主肠道微生物(intestinal microbiota, IM)群落的失调引起。白便综合症(white feces syndrome, WFS)是一种严重威胁全球虾类的非传染性疾病,它与肠道微生物的改变有关,但还没有实验对此进行验证。作者综合利用16S扩增子、宏基因组和代谢组分析及肠道微生物移植(intestinal microbiota transplantation, IMT),对IM和WFS之间的因果关系进行了探索。


2、结果

与健康虾相比,WFS病虾的微生物丰度及多样性急剧降低,10个属的细菌如Vibrio、Candidatus Bacilloplasma、Photobacterium及Aeromonas在病虾中富集,而健康虾中富集的是其他11个属的微生物,包括Shewanella、Chitinibacter和Rhodobacter等。病虾微生物群落的改变会削弱硫辛酸代谢和矿物质吸收途径。像脂类和有机酸这样的一系列代谢物与WFS病虾的IM改变有关。通过多组学关联网络,我们揭示了虾类WFS与微生物群落结构、功能潜力及IM代谢密切相关。饮食补充实验确定了导致IM失调的代谢产物。此外,接受WFS微生物移植的健康虾最终也表现出了WFS的病症,而接受健康虾IMT则可以恢复病虾的肠道群落,饲料中添加代谢产物可以导致IM失调。


二、实验设计

1、虾样本及其IMT:选取平均体长9cm的虾,分别获取健康虾和WFS病虾的肠道IM,再移植到其他虾中,同时以移植PBS作为对照。

2、饮食补充代谢物:选择在WFS病虾中富集的且与细菌相关的9种代谢物用以饮食补充,喂养一周后取虾肠道进行IM分析。

3、测序和代谢分析:提取虾肠道DNA并进行16S rRNA(V4区)和宏基因组测序;使用LC/MS技术对虾肠道样本进行代谢组分析。

4、分子生态网络分析:对健康组和病虾组的物种互作关系进行分析,找出其中的关键物种。

5、群落组装机制研究:对健康组、病虾组、IMT组和对照组的细菌群落组装机制进行分析,比较各个生态过程在不同组的贡献度。


三、实验结果

1、WFS症状和组织病理学

WFS病虾活动减弱、停止摄食,排出的粪便为白色,病虾中肠膨大且充满白色内容物,而健康虾的中肠则是棕色且里面是粪便(图1a)。病虾的肠道上皮细胞脱落,微绒毛减少或消失,中肠也较薄(图1b)。

2、健康虾和WFS病虾的IM组成比较、功能变化及代谢特点

对75个健康虾样本和84个WFS病虾样本进行测序,共得到12024种OTU,分类到了61个门、1135个属。病虾的α多样性显著低于健康虾(图1c),且两类虾的细菌群落明显不同(图1d)。WFS样本的PCoA中心距离显著高于健康组(图1e),说明病虾IM群落结构的均匀度低于健康虾。

WFS病虾的症状、组织病理及微生物特点 

图1 WFS病虾的症状、组织病理及微生物特点


10个细菌属如Vibrio、Candidatus Bacilloplasma、Photobacterium、Aeromonas等在WFS病虾中富集,而在健康虾中富集的是其他11个属的微生物,包括Shewanella、Chitinibacter及Rhodobacter等(图1f)。将167种OTU作为疾病的biomarkers,基于这些markers可计算出病虾的疾病概率指数(probability of disease index, POD)远高于健康虾,该指数在此的正确率达99.4%(图1g)。

从7个健康虾样本和6个WFS病虾样本中共得到68.9Gb的宏基因组数据,KEGG数据库评估结果表明这2组虾的IM功能结构存在巨大差异(图2a)。病虾的13条代谢途径,如矿物吸收、硫辛酸代谢等显著减少,而涉及细菌趋化、溶酶体、鞭毛组装等14条代谢途径则有所增加。

KEGG注释结果表明健康虾和病虾的代谢存在显著差别(图2b),LC/MS实验中两组差异巨大的代谢成分有35种,包括胆酸、石胆酸、亚油酸、肉豆蔻酸、大豆苷元及大豆黄素等。

健康虾和病虾中微生物基因功能和代谢模式比较
图2 健康虾和病虾中微生物基因功能和代谢模式比较


3、微生物组、宏基因组和代谢组的整合

35种代谢产物和21类细菌属之间存在显著的关联。健康组中富集的Chitinibacter与十种代谢产物如胆酸、苯乙胺等正相关,而与九种代谢物如癸二酸和琥珀酸等负相关。患病组中富集的Vibrio与十种代谢产物如油酸、癸二酸、琥珀酸等正相关。与最多致病属都相关的代谢物是癸二酸和琥珀酸,它们可能是引发WFS的重要物质。

Vibrio和Lactobacillus与聚酮、氨基酸和甾醇脂类显著相关,而Candidatus Bacilloplasma 及Chitinibacter与脂肪酰和甘油胆碱存在联系(图2c),以上4类细菌和Rhodobacter都是在网络分析中与其他物种联系最紧密、和疾病相关的核心物种。


4、IMT和移植前后的IM特点

将病虾的IM移植到30只健康虾中(C+W1)(图3a),其中的11只出现了典型的WFS症状(图3b c),而移植PBS(C+P1)和健康虾(C+C)IM的虾并无任何WFS症状。将病虾的IM滤液(C+WF)移植到健康虾中也不会引起WFS,说明病毒与该疾病无关。

将C+W1组的6只病虾作为第二次IMT的供体,30只健康虾分别移植IM(C+W2)和PBS(C+P2),前者导致8只虾患病(图3d),而移植PBS的虾不患病。有趣的是,30只病虾在移植健康虾IM(W+C)后,13只恢复了健康(图3e)。以上结果证明WFS和IM失调确实存在因果关系。

IM移植导致WFS相似症状的出现
图3 IM移植导致WFS相似症状的出现


C + W1和C + W2组的α多样性明显低于C + P1和C + P2组(图4a),且前两组和WFS组明显聚类到了一起(图4b)。致病菌属Vibrio、Photobacterium、Candidatus Bacilloplasma及Aeromonas在C + W1和C + W2组的丰度很高,而Shewanella、Chitinibacter、Rhodobacter在C + P1和C + P2组中更少(图4d,e)。以上模式与健康虾和病虾IM组成的改变是一致的(图1)。此外,WFS与健康组中富集的属彼此间负相关(图4f)。接受健康虾IM移植后,病虾的IM的α多样性增加,群落组成也与健康组相似。病虾的POD值非常高(图4c),这也证明了IM失调是导致WFS的因素。

新患病虾的IM失调

图4新患病虾的IM失调


5、饮食补充的代谢物与IM失调有关

用9种代谢物分别喂养虾一个星期。辛酸、肉豆蔻酸、N -乙酰- D -氨基葡萄糖的补充使IM的Shannon指数显著降低。十五烷酸和油酸的补充增加了Vibrio的丰度,而癸酸、石胆酸等增加了Candidatus Bacilloplasma的丰度。与此相反,辛酸、十五烷酸、癸酸等降低了健康组中Shewanella的丰度,前两者还让Chitinibacter的占比也大幅下降了。代谢物补充组明显比对照组的POD值要高很多。总之,这些代谢物是虾类IM结构的决定因素,即饮食营养直接关系着虾的健康。


6、健康虾和WFS病虾中的分子生态网络

网络图有利于了解物种互作关系(图4g)。与健康组IM相比,患病组的平均物种关联性低,连接路径长,说明物种的互作更少也更复杂。健康组的核心node是Proteobacteria,而WFS组的则是另外一个包含Bacteroidetes和Chloroflexi的门。患病组网络图中Vibrio、Shewanella、Candidatus Bacilloplasma及Chitinibacter是与周围物种联系最密切的4个枢纽。


7、生态过程的贡献比较

比较各组的ses.MNTD值的大小,与健康虾相比,疾病虾的肠菌组装中的确定性过程减弱,随机性过程增加(图5).通过Null model分析,疾病虾的同质选择过程和异质选择过程的贡献度显著降低(图6)。

生态过程的贡献比较
图5 生态过程的贡献比较


生态过程的贡献比较
图6 生态过程的贡献比较


四、小结与亮点

本研究综合利用多组学和代谢组学,比较了健康虾和WFS病虾的肠道微生物群落情况,以及IMT实验和代谢物补充对WFS的影响。结果表明,WFS病虾的肠道功能损伤,IM结构失调,大量富集疾病相关微生物,如Vibrio、Candidatus Bacilloplasma、Photobacterium及Aeromonas等10个属,而缺少了健康虾中富集的Shewanella、Chitinibacter和Rhodobacter等11个属。IMT实验也证实了IM群落的结构决定着虾的健康。而9种代谢物的补充会改变IM结构,从而导致WFS的发生,说明了饮食营养对于虾类健康的重要性。总之,本研究利用多组学和实验验证(图7),从生态学角度了解了新的水生动物致病机理,为将来的研究提供了参考。


柯赫氏法则揭示肠道微生物失调导致虾白便综合症




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